据传说，在最后的晚餐中，耶稣使用的圣杯具有让人永生不老的神奇力量。这个传说引起了许多放荡不羁的人的兴趣，他们开始寻找圣杯的存在。印第安纳琼斯博士（由哈里森·福特饰演）也加入了这个寻找圣杯的行列，甚至他的父亲老琼斯（由肖恩·康纳利饰演）也卷入了其中。然而，在给琼斯留下圣杯线索的老琼斯消失后，他们陷入了困境。琼斯和史奈达博士（由艾莉森·杜迪饰演）来到了威尼斯，并在图书馆里找到了圣盾的线索，但却遭到了神秘的十字剑兄弟的追杀。经历了一系列的波折后，琼斯终于找到了他失踪已久的父亲，并发现史奈达实际上是纳粹间谍，她偷走了圣杯的线索。现在，圣杯有可能落入纳粹手中。为了拯救圣杯，父子俩开始合作，并展开了一场惊险刺激的冒险之旅！