1986年，于慧考入上海戏剧学院表演系。在校期间参加了电视剧《聊斋-云翠仙》的拍摄。1990年，毕业分配到上海电影制片厂任演员。
1989年，于慧主演杨延晋执导的剧情电影《地狱·天堂》，在片中饰演身世坎坷的静玲。同年在黄蜀芹执导，陈道明、吕丽萍主演的电视剧《围城》中饰演汪太太。
1990年，于慧在剧情电影《喋血金兰》中饰演戏院名伶祁曼苓；同年在史蜀君执导的剧情《燃烧的婚纱》中饰演费家世交夏元善的女儿夏若青。
1991年，于慧搭档祝延平主演石晓华执导电影《情洒浦江》。
1993年，搭档张光北、于小慧主演剧情电影《血染桃花水》，在片中饰演林海雪原中的完达部落寡妇碛的寡妇。同年与许还山、王志文主演民国剧《大屋的丫环们》，令广大电视观众认识。
1994年，在陈家林执导，刘晓庆、陈宝国主演的古装历史剧《武则天》中饰演唐高宗李治的妃嫔萧淑妃。
1996年，再次与导演陈家林合作，出演其执导的历史剧《汉武帝》饰陈皇后。同年与杨童舒主演电视剧《叶赫那拉公主》。与陈道明、葛优合作主演《上海人在东京》。同年凭借主演的农村题材电影《喜莲》获得第3届中国电影华表奖最佳女演员、第17届中国电影金鸡奖最佳女主角、第19届小百花奖优秀女主角奖以及第6届中国电影表演艺术学会金凤凰奖。
2001年，与盖丽丽、廖京生联合主演都市生活剧《生活秀》饰来双扬。在陆剑民、王志飞主演的军旅题材剧《导弹旅长》中饰演林静。与赵燕国彰主演叶鸿伟执导的经典警匪悬疑剧《插翅难逃》。
2002年，凭借主演孙沙执导的剧情电影《巧凤》获得第8届中国电影华表奖优秀女演员奖。
2006年，与萨日娜、丁海峰、颜丙燕主演农村题材电影《心灵的天空》，在片中饰演基层的女性计划生育工作者。
2007年，在李万年、曹翠芬主演的家庭伦理剧《老伴》中饰演马丙坤的四闺女马建秋。同年与李颖联合主演家庭情感剧《洒满阳光的小院》，在剧中饰演建筑设备机械厂职工韩素云。
2008年，主演阚卫平导演，高满堂编剧的作品《金达莱》，凭借该剧摘得了第三届新农村电视艺术节最佳女主角奖。
2009年，主演根据黄步千的小说《濠河人家》改编的电视电影《濠河边上的女人》。
2010年，主演的人物传记剧《赵丹》在中央八套播出，并随着导演翟俊杰、主演邢岷山做客《今夜有戏》。
2011年，领衔主演张晓春执导的抗日战争剧《母子情仇》，在剧中饰演土匪刘和尚的压寨夫人田彩霞。3月参与朱雨辰、马苏主演的婚姻情感剧《小夫妻时代》，饰演戴可可的母亲杨惠玲。
2012年，搭档孙海英主演乡村伦理剧《阳光路上》，在剧中饰演善良坚韧、泼辣进取的梨树村普通农民柳春香。
2016年，凭借盛林、李勇导演的电影《遥远的约定》夺得47届美国纳什维尔国际电影节最佳女主角。
2012年，于慧作为公益活动“中国禁毒志愿者汽车万里行”的禁毒宣传大使出席了上海站的系列宣传活动。
2015年12月23日，作为嘉宾出席了第30届中国电视剧飞天奖典礼。
2016年1月25日，作为颁奖嘉宾出席上海首届公益微电影颁奖。
2017年6月17日，受邀出席第20届上海国际电影节开幕式红毯。
2017年7月21-22日，携手上影演员剧团登上东方艺术中心，参与《声影》演出，庆祝中国人民解放军建军九十周年。
2018年，受邀参加“FashionWorld”时尚盛典，并获得香港卫视时尚台荣誉大使。
个人奖项
于慧有“三好”：一是演技好，从《围城》中的汪太太、到《喜莲》中的农家女喜莲、再到《巧凤》中的党支部书记巧凤，于慧演艺的形象给人留下深刻影响；二是形象好，清水出芙蓉，天然去雕饰，于慧健康而自然的形象，令她散发着特别的妩媚；三是艺德好，工作中的于慧吃苦耐劳，任劳任怨。