马云飞和高寒的婚礼当天，他们受到了一个意外的访客——老于，他是“五号特工组”的老朋友。老于恳求他们再次出山，执行一项其他人无法完成的任务：追查双重间谍吉川猛夫，他窃取了美国核武器资料。为了这个任务，高寒决定做一个落跑新娘，跟随欧阳剑平和李智博一起前往云南。马云飞和何坚也被迫重新加入行动。于是，“五号特工组”的五位成员：欧阳剑平、李智博、马云飞、高寒和何坚再次集结在一起。与此同时，日本方面派出了高级女间谍酒井朝香，她是酒井美惠子的亲妹妹，手段更加毒辣和凶狠。“五号特工组”遭遇了倒霉的开端，被吉川猛夫的同伙陷害入狱，他们只能集体越狱。他们一边躲避美军的追捕，一边追击吉川猛夫，最终找到了美军内部的叛徒，抢在酒井朝香之前找到了被盗的核武器资料。战事越发激烈，前线士兵大规模感染了病毒，五号特工组被派去调查。在路上，他们与病毒的幕后操纵者桥本失之交臂。桥本是一个科学怪人，他将高寒注射了病毒，将她当作实验品绑架起来。马云飞、李智博和何坚深入滇缅边境，经过艰苦的森林追击战，找到了敌人在缅甸的生化基地。高寒为了拿到病毒血清，救助了前线的大批战士，差点丧命。战事紧急，前线物资匮乏。蒋介石盯上了阎锡山早年私藏的军火，但阎锡山拒绝供给军需，理由是军火库的建造者李阳失踪了。戴笠不得不再次求助于五号特工组，让他们潜入山西，寻找李阳的下落。五号特工组利用日军司令风间义博喜欢中国画的爱好，偷走了蒋介石家里的古代名画，以此引诱风间义博上钩。通过卖画，他们深入了风间义博居住的司令部，偷拍了日军晋中会战的战斗记录和名单。此时，酒井朝香也来了，马云飞巧妙地应对，成功逃出了日军司令部。五号特工组按照线索，马云飞和何坚通过假供词的手段，进入康坑归化监狱，终于取得了监犯领袖朱非的信任，帮助他越狱。朱非行动失败，临死前告诉马云飞，自己就是李阳，五号特工组终于在日本人之前找到了军火库。五号特工组带着宋美龄心爱的国画回到重庆，准备完成任务。然而，他们在机场遇到了美国飞虎队队长陈纳德遭受袭击。五号特工组被老于和戴笠堵在了门口。他们从重庆机场的枪击现场开始调查，利用物理学、枪械知识以及心理学和推理演绎等手段，从有限的线索中还原了枪击现场，最终揭开了日本人的刺杀阴谋。揭开真相后，马云飞等人为了保护陈纳德来到重庆，陈纳德的夫人请来了美国的保镖罗特。罗特对马云飞等人的行动表示不满，而且一连串的意外让五号特工组陷入了被动。马云飞等人经过一番努力，揭示了一切事件的真凶，原来是保镖罗特冒充了真正的罗特。五号特工组接到中国远征军孙立人将军的邀请，要他们将一份重要的河道图送到缅甸。随行的还有一位记者崔媛媛，她是马云飞的老同学，但高寒对她心生嫉妒。然而，他们不知道崔媛媛其实是易容后的酒井朝香，她杀害了真正的崔媛媛并冒充了她，目标是混入远征军基地，协助日本轰炸机进行轰炸。只有高寒识破了酒井朝香的真面目，其他人却认为她是因嫉妒而产生怀疑，不信任她的话。当他们一个个被酒井朝香送进陷阱，引导日本轰炸机的篝火即将点燃时，离队已久的欧阳剑平及时赶到，带来了陈纳德的救援。酒井朝香重蹈了她姐姐的覆辙，五号特工组再次团聚，但高寒和马云飞这对恋人却成了陌生人。